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重組克隆的篩選與鑒定

重組克隆的篩選與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)篩選，獲得含目的片段的重組克隆。掌握利用酶切或PCR方法進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這...

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研究生實(shí)驗(yàn)-大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。獲得感受態(tài)細(xì)胞；制備含有目的片段的陽(yáng)性克隆。二、實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。...

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分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-DNA重組技術(shù)

DNA重組技術(shù)（連接）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康捏w外連接獲得重組分子，用于轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開(kāi)，經(jīng)分離純化后，用連接酶將其連接，構(gòu)成新的DNA分子。外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切...

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分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-載體和目的片段的酶切

實(shí)驗(yàn)三、載體和目的片段的酶切A載體和外源DNA的酶切一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握核酸的酶切操作原理；通過(guò)酶切獲得可進(jìn)行體外重組的載體和外源DNA。二、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的...

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RAW264.7細(xì)胞系在破骨細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，在骨發(fā)育、生長(zhǎng)、修復(fù)、重建中起著重要的作用。由于破骨細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量較少且分離困難，目前常用的誘導(dǎo)法之一是利用RAW264.7細(xì)胞系進(jìn)行破骨細(xì)胞培養(yǎng)。本文重點(diǎn)介紹了RAW264.7細(xì)胞系誘導(dǎo)法，以及調(diào)節(jié)信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子。破骨細(xì)胞是調(diào)節(jié)骨組織代謝的重要細(xì)胞類型，在骨發(fā)育、生長(zhǎng)、修復(fù)和重建中起著至關(guān)重要的作用。然而，由于破骨細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量少且分離困難，研究者需要尋找合適的方法來(lái)進(jìn)行破骨細(xì)胞的培養(yǎng)。近年來(lái)，利用RAW264.7細(xì)胞系進(jìn)行破...

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